氨基寡糖素的研究进展

壳寡糖植物疫苗(生物农药)的研制属中国科学院“九五”重点、农业部“948”计划项目。是在中国科学院大连化学物理研究所糖生物学与糖工程课题组多年研究基础之上,以来源丰富的海洋生物资源为原料,通过糖生物学及寡糖工程技术,研制开发的对粮食作物、经济作物、蔬菜、水果、花卉等具有提高免疫力、增强抗病虫性和调节生长发育、改善品质、增产增收功能的绿色产品。
 
壳寡糖(oligochitosan)是由2-10个氨基葡萄糖以β-1,4-糖苷键连接而成,它对植物的调控作用不同于传统的生物农药和化学农药,不但可以提高植物的抗逆性(包括抗病性、抗寒和抗旱性等),同时还可以促进作物的生长,提高作物的品质。田间试验结果表明壳寡糖植物疫苗对小麦赤霉病、棉花黄萎病、大豆花叶病等多种植物病害具有明显的防治效果。此外对其它水果、蔬菜及花卉等病害也具有明显的防效和促生长作用,同时可提高产量13%-30%。如壳寡糖植物疫苗可显著提高苹果、梨的抗寒性及坐果率(与对照比可提高10倍)。保叶率达80%左右。壳寡糖与杀菌剂混用,可以大幅度降低杀菌剂的用量(最高降低化学农药用量的90%),防治作物病害及提高产量效果明显。壳寡糖植物疫苗因其独特的作用机理已经成为一类全新的绿色生态农药。目前该项研究已达国内领先,其中中科3号、中科6号及青岛颂田氨基寡糖素的制备应用技术达到国外先进水平。并且获得了农业部2%氨基寡糖素水剂和2.8%葡聚寡糖素水剂寡聚糖农药临时登记证书。
 
壳寡糖在种植业中的应用
 
1、在植物抗病性方面的应用
目前 , 针对壳寡糖诱导植物产生抗病性的研究较多,报道的作物涉及有烟草、水稻、番茄、棉花、小麦、草莓、油菜等作物。烟草黑胫病菌 ( Ph y t o p h t h o r aparasitica var nicotianae,Ppn)是种严重危害烟草的病原真菌,破坏性极强,大田侵染后常造成烟株成片凋萎死亡 , 给烟草生产造成严重损失。赵进成(2008)研究了离体条件下 , 壳聚糖对烟草黑胫病菌的抑制作用,结果显示:对照菌丝形态规则 ,内含物丰富 , 常见菌体细胞内含大量的大颗粒代谢物;而壳聚糖处理过的菌丝形态出现了较多的扭曲、膨胀等畸变 , 菌丝分枝不规则,颗粒细小稀少 ,内含物较少。壳聚糖对的Ppn形态结构和新陈代谢具有明显的影响。壳寡糖是植物识别病原真菌入侵的非特异性信号 , 对许多植物显示出强烈的免疫诱导活性 , 可以激发植物的基因表达 ,产生抗病的甲壳素酶、壳聚糖酶、植保素和免疫蛋白, 这些物质能抑制和杀灭病菌生长,  达到抗病的目的。Chen  Fang(2007)认为 , 壳寡糖是结合在质膜上并激发多种防御反应的诱导子。水稻经 COS 处理 12 小时和 24 小时后, 在二维凝胶电泳蛋白质片段上总共有 14个正负调控蛋白质点。其中有八个蛋白质点被质谱法成功识别 , 并推测存在细胞膜上,功能是参与植物防御。
 
Day等(2001)研究了几丁质寡糖在大豆细胞膜上的结合位点。通过 125I 标记的壳寡糖与大豆细胞膜的结合 , 在大豆悬浮细胞和根部组织中鉴定及表征出一个 85KD 的几丁质结合蛋白。抑制分析表明聚合度较大的壳寡糖分子(例如聚合度为8)在50nM的浓度下容易与大豆细胞膜发生结合 , 抑制率为50%。而乙醯葡萄糖氨和壳二糖即使浓度达到 250μM 也没有抑制作用。值得注意的是,Bradyrhizobium  japonicum产生的脂几丁质寡糖根瘤信号表现为配体结合的竞争性抑制剂。
 
2、促进植物生长
张文清等(2002)研究发现,当黄瓜幼苗长至3~4片真叶时,叶面喷施w=1.0×10-4的壳寡糖产品(分子量=2000~3000),对黄瓜的生长有很好的促进作用。受冻的黄瓜经壳寡糖处理后,其长势明显好于对照,处理过的植株果实采收期可比对照提前3 ~5d,产量也明显高于对照。陆引罡等(2003)利用壳聚糖酶降解壳聚糖获得的壳寡糖为基本成分, 配以化肥、微量元素及防腐剂等成分进行混合, 调制成较稳定的胶体溶液后拌种, 对油菜种子发芽和出苗均无明显影响 , 但可促进油菜生长 , 提高壮苗率 , 增加产量,增产幅度在4.33%~9.67%。分子量2000以下的壳低聚糖溶液进行小麦、豌豆等拌种 , 提高抗病能力、抗倒伏能力、增产可达10%~30%。Staehelin,C(1995)研究发现 , 根瘤菌与豆科植物共生的信息分子固氮结瘤因子即lipo-chitino-ligosaccharides( L C O )也是一种寡聚糖。Z h a n g , H 等(2002)研究了温度和染料木素对野生大豆根瘤菌突变株产生的LCO固氮结瘤因子的影响。研究发现,在高染料木黄酮水平(0.1和1uM),所有突变株都产生较多LCO;在三种温度的实验中,突变株Bj30054,  Bj30056and  Bj30057产生的LCO较野生型USDA  110or  532C为多,从而更利于后期大豆的生长。李艳等(2008)用50mg  L1壳寡糖溶液喷施油菜的幼苗叶片后 , 发现干旱胁迫下油菜叶片的净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)、胞间CO2浓度(Ci)显著提高;气孔限制值(Ls)显著降低。说明壳寡糖有助于减轻气孔限制引起的净光合速率的降低, 从而可以在干旱条件下积累较多的同化产物以促进生
长。
 
3、改善农产品品质
江晓路(2005)根据壳寡糖自身所特有的物理化学特性, 将其配制得到了一种溶液并应用于烟草(丝)中 , 不仅能够提高烟草(丝)在贮存、加工等过程中的保湿、抑菌性能,同时显著提高烟的燃烧性,尝味性及烟的提神效果, 并减少在吸烟过程中有害物质如具有纤毛毒性的醛类及烟碱等生物碱及某些挥发性的有机酸(如甲酸、乙酸、氢氰酸等)对人体的伤害。王黎明(2008)研究发现 , 叶面喷施壳寡糖有助于提高 β一葡萄糖苷酶活性, 因此有利于提高茶叶的风味。T.Tahirou(2006)研究发现酸奶中添加低分子量的壳寡糖可赋予酸奶更优良的品质。
 
4、在组织培养中的应用
壳寡糖在叶片培养中可起到生长激素的作用, 同时对培养基及外植体起到了防污抗病的保护作用。张琪(2008)以普通狗牙根的成熟种子作外植体, 研究了直接添加壳聚糖和用壳聚糖水溶液浸种对愈伤组织诱导和植株分化的影响。结果表明, 壳聚糖的直接添加和浸种均能够显著提高愈伤组织的诱导率。李春香(2008)研究了低聚壳聚糖对红掌组培污染菌的抑制作用, 结果表明:分子量为3000的壳聚糖抑菌率最高达62.5%, 初步证实了低聚壳聚糖对组培污染菌类有很好的抑制作用。
 
5、杀虫方面的应用
Yun  K  S.等(2002)研究发现壳寡糖与藻酸盐 ,与 10%壳聚糖溶液(相对分子质量为140~100 000)混合后,再加入一些稳定剂得到的混合物具有杀虫活性。壳寡糖对鳞翅目和同翅目害虫均具有一定的杀虫活性,  对小菜蛾的杀虫活性高于对棉铃虫。壳寡糖以及低聚壳聚糖是甲壳素、壳聚糖系列产品的高级产品, 较甲壳素和壳多聚糖具有水溶解性好、生物活性高、功能作用广的特点, 这些特点决定了壳寡糖在诱导植物产生抗病性,促进作物生长,改善作物品质 , 延长果实保鲜期等诸多方面具有广阔的应用价值。自从上世纪中叶甲壳素被发现到壳寡糖或低聚壳聚糖的广泛研究与应用, 前人开展了大量的研究, 在利用甲壳素或壳聚糖的物理降解、化学降解和生物降解方面,以及甲壳素或壳聚糖在医学保健领域的研究开展得较为全面和深入, 取得了较为丰硕的研究成果。但是壳寡糖和低聚壳聚糖在农业方面的应用研究较为滞后 , 尚有许多方面值得深入研究:如壳寡糖和低聚壳聚糖因其成分复杂, 分子量范围跨度较大,严重影响了科学试验研究与应用推广的重复性 , 因此如何制备精确分子量的低聚壳寡糖是值得深入研究的首要内容之一;其次 , 壳寡糖在能够提高作物的抗旱性或者抗寒性方面的理论研究或应用研究几近空白状态;再次, 壳寡糖或低聚壳聚糖诱导植物产生抗病性, 促进生长方面更为详细的机理, 比如诱导的信号转导细节、在细胞表面的受体、诱导基因的克隆与表达等方面,将是今后科研工作中的重点内容之一。